為研究再生水回用過程中的生物安全風(fēng)險，對兩座城鎮(zhèn)污水處理廠再生水樣品中人源微生物污染、耐氯大腸桿菌分布及細(xì)菌耐藥性情況進(jìn)行調(diào)查分析。結(jié)果顯示，85.7%的再生水樣品存在人源微生物污染風(fēng)險；再生水中共分離到8株耐氯大腸桿菌，占所分離大腸桿菌的20% (8/40)，為我國首次報道該菌存在，該菌的出現(xiàn)對水處理過程中微生物的有效消殺提出了挑戰(zhàn)；50%(20/40)的大腸桿菌至少耐受一種抗生素，10%耐受至少3中抗生素，3株大腸桿菌呈ESBL陽性，說明再生水具有耐藥性細(xì)菌傳播風(fēng)險。因此，污水處理廠應(yīng)優(yōu)化處理工藝，提高對耐氯菌的消殺水平，并通過多部門聯(lián)合治理以控制耐藥菌傳播，提高再生水的生物安全性。

污水再生回用是緩解水資源短缺的有效途徑，目前再生水已被用于城市景觀、農(nóng)田灌溉、地下水回灌、工業(yè)冷卻水、洗車等。然而再生水中可能含有多種病原微生物（如病毒、細(xì)菌、寄生蟲等），因此保障再生水的生物安全性至關(guān)重要。

再生水生產(chǎn)工藝包含多種微生物去除手段，其中物理手段包括膜過濾、紫外線，化學(xué)手段主要包括加氯消毒及臭氧消毒。氯消毒方式應(yīng)用較為廣泛，它主要利用次氯酸（HClO）和二氧化氯（ClO2）的氧化特性，破壞微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA和RNA等，達(dá)到殺菌效果。Zhi等人的前期研究發(fā)現(xiàn)污水中存在高耐氯菌，這類菌株還攜帶耐熱基因，具有很強(qiáng)的耐熱性，同時攜帶特異性DNA標(biāo)記uspc-IS30-flhDC。這些耐氯菌株的出現(xiàn)將降低氯消毒的殺菌效果，威脅再生水的生物安全性。

再生水中細(xì)菌耐藥性問題也是目前關(guān)注熱點(diǎn)。污水中含有大量的微生物，為基因水平轉(zhuǎn)移（HGT）提供了良好環(huán)境。通過HGT，抗性基因可傳遞到某些致病菌中，反之毒力基因也可傳遞到抗性菌中，促進(jìn)了抗性致病菌的出現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，氯消毒可提高污水所含抗生素基因含量這些都對再生水的微生物安全造成巨大挑戰(zhàn)，若處理不當(dāng)則可成為耐藥菌傳播的源頭。為此，以寧波市兩家污水處理廠的再生水為例，調(diào)查其進(jìn)水及再生水中是否存在耐氯大腸桿菌，并測定再生水中大腸桿菌的耐藥性，了解細(xì)菌耐藥情況。

01 水樣來源及處理工藝

選取寧波市兩座污水處理廠(A廠和B廠)，采集進(jìn)水及再生水水樣。兩廠進(jìn)水主要為生活污水，A廠采用高效沉淀池+濾布濾池工藝，經(jīng)紫外消毒后回用，B廠采用MBR+D型濾池工藝，經(jīng)紫外消毒后回用。

02 結(jié)果

2.1 再生水廠日常檢測指標(biāo)

為保障再生水回用安全，我國已出臺相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，對再生水用于農(nóng)田灌溉、景觀環(huán)境、工業(yè)及城市雜用（如沖廁、消防、車輛沖洗等）作了規(guī)定。A、B兩座污水處理廠所產(chǎn)再生水的常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)如表1所示，均達(dá)到了《城市污水再生利用 景觀環(huán)境用水水質(zhì)》（GB/T 18921—2019）要求。

由表1可知，兩廠所產(chǎn)再生水中的糞大腸菌群指標(biāo)遠(yuǎn)小于農(nóng)業(yè)灌溉用水、景觀用水、工業(yè)用水的限值要求。因此從生物安全性角度，其不僅可用于河道補(bǔ)給，還可拓展應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)及景觀用水。然而《城市污水再生利用 城市雜用水水質(zhì)》中要求大腸桿菌不能檢出，因此目前兩廠所產(chǎn)再生水不能直接用于沖廁、車輛沖洗、城市綠化、道路清掃、消防、建筑施工等城市雜用。

2.2 進(jìn)出水人源微生物污染檢出率

經(jīng)測定，所有進(jìn)水樣品均檢出人源微生物污染HF183分子標(biāo)記，即檢出率為100%。14個再生水樣品中共有12個檢出人源微生物污染HF183分子標(biāo)記，即檢出率為85.7%，其中A廠檢出率為100%，B廠檢出率為71.4%，表明兩廠再生水中存在人源微生物污染可能性。

2.3 再生水廠進(jìn)出水耐氯菌的檢出率

14個污水處理廠進(jìn)水水樣共有7份樣品檢出耐氯大腸桿菌uspc-IS30-flhDC分子標(biāo)記，檢出率為50%，其中A廠檢出率為42.9%（3/7），B廠檢出率為57.1%（4/7）。14份再生水樣品中共有2份檢測出含有耐氯大腸桿菌uspc-IS30-flhDC分子標(biāo)記，檢出率為14.3%，其中A廠和B廠的檢出率均為14.3%。

A廠7份再生水樣品中僅有3份樣品有菌落生長，但菌落特征顯示全部為非糞大腸菌群菌落。B廠7份樣品全部長出糞大腸菌群菌落，通過分離鑒定共獲得40株大腸桿菌，其中耐氯大腸桿菌8株。耐氯菌株來自6份再生水樣品，因此再生水耐氯大腸桿菌總檢出率為42.9%（6/14），6份樣品全部來自B廠，B廠的耐氯大腸桿菌總檢出率為85.7%（6/7）。該結(jié)果表明， A廠所產(chǎn)再生水具有較高的生物安全性。然而在采樣期間B廠加氯設(shè)備未運(yùn)行，僅使用紫外一種消毒方式，工藝流程的差異可能導(dǎo)致了A廠所產(chǎn)再生水水質(zhì)優(yōu)于B廠，未能從A廠再生水樣品中分離到大腸桿菌。

兩廠14份再生水樣品DNA中僅有2份含耐氯大腸桿菌uspc-IS30-flhDC分子標(biāo)記，然而，通過對相同14份再生水樣品過濾膜并在MFC培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)糞大腸菌群后，共從6份樣品中分離得到耐氯大腸桿菌。導(dǎo)致出現(xiàn)上述差異的原因可能是在對樣品進(jìn)行選擇性培養(yǎng)后，大腸桿菌數(shù)量大量增加，因此分離得到耐氯大腸桿菌的概率增大。該結(jié)果提示可通過對樣品前處理，增加選擇性培養(yǎng)步驟，提高耐氯菌的分離率。

2.4 再生水中大腸桿菌耐藥性

本研究所分離40株大腸桿菌對氨芐西林的耐藥率最高為40%，其次為復(fù)方磺胺(20%)、環(huán)丙沙星(15%)、ESBL(7.5%)、阿莫西林/克拉維酸(7.5%)、頭孢曲松(7.5%)、頭孢西丁(5%)、氨曲南(5%)、左旋氧氟沙星(5%)、慶大霉素(2.5%)、呋喃妥因(2.5%)，見表2。分離得到的大腸桿菌50%至少耐受1種抗生素，5株菌耐受2種抗生素，耐受4種和5種抗生素的菌株各1株，耐受8種抗生素的菌株共2株。40株大腸桿菌中的8株耐氯菌，僅有2株對氨芐西林耐受，1株對復(fù)方磺胺耐受，其余5株對所有抗生素敏感。

03 討論

近年來，隨著城市人口劇增和經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，全球水資源嚴(yán)重不足。與此同時，全球變暖導(dǎo)致的極端氣候頻發(fā)愈發(fā)加劇了水資源短缺。再生水作為緩解水危機(jī)的重要途徑之一，不僅可用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及市政雜用，在國外某些缺水地區(qū)甚至已嘗試將再生水用作生活飲用水間接補(bǔ)充水源。然而再生水水源含有大量污染物，因此在其回用過程中不僅存在化學(xué)性危害風(fēng)險，其所攜帶的病原微生物對人類的生物安全性風(fēng)險也不容忽視。

研究發(fā)現(xiàn)，在A廠一些再生水樣品中未能檢測到糞大腸菌群，然而這些樣品均含有人源微生物污染標(biāo)記物HF183，存在攜帶致病微生物風(fēng)險，說明僅檢測糞大腸菌群不能對再生水安全性進(jìn)行準(zhǔn)確評估。Harwood等人的研究也顯示僅使用個別腸道指示菌（如總大腸菌群、糞大腸菌群、糞腸球菌等）無法準(zhǔn)確反映再生水中致病微生物情況。目前我國多項國家標(biāo)準(zhǔn)將檢測糞大腸菌群作為再生水生物安全性評價唯一手段，急需引入其他檢測方法，提高再生水生物安全評估技術(shù)水平。隨著測序技術(shù)及生物信息學(xué)的發(fā)展，使用宏基因組技術(shù)對樣品中所有微生物進(jìn)行檢測，在經(jīng)濟(jì)和技術(shù)層面的實施性已完全具備。宏基因組技術(shù)通過測定樣品中全部核酸序列，可對樣品中所有微生物的種類及豐度進(jìn)行鑒定。因此可將宏基因組技術(shù)應(yīng)用到再生水回用領(lǐng)域，實現(xiàn)對其生物安全性的全面精確評估。

為保障出水生物安全性，污水處理廠水質(zhì)凈化過程需包括消毒處理，加入氯消毒劑為最常用消毒手段。目前我國氯消毒劑使用量非常巨大，那么在氯消毒劑的巨量使用所提供的強(qiáng)大進(jìn)化選擇壓力下，是否會出現(xiàn)耐氯處理致病微生物？大量研究證明，當(dāng)暴露于有害環(huán)境因素后，細(xì)菌基因組的高可塑性，使其可進(jìn)化出抵御機(jī)制來保障自身正常生存繁殖，例如細(xì)菌的耐抗生素、耐重金屬、耐熱性等特性便可通過基因突變或獲取外源抗性基因獲得。因此大量的氯暴露，必然導(dǎo)致耐氯菌的出現(xiàn)。作者前期研究便發(fā)現(xiàn)一些大腸桿菌更適應(yīng)在污水中生存，這些大腸桿菌對氯的抗性高達(dá)標(biāo)準(zhǔn)菌株的100倍，并攜帶一個特異性DNA標(biāo)記uspC-IS30-flhDC。目前已在加拿大、瑞士、美國污水中發(fā)現(xiàn)該類耐氯大腸桿菌。本研究中，B廠7份樣品耐氯大腸桿菌檢出率達(dá)85.7%（6/7），說明本地污水系統(tǒng)中存在耐氯大腸桿菌，為首次在我國報道此菌，說明該菌已在全世界范圍流行。該菌株的耐氯性和耐熱性分別為普通菌株的100倍和100萬倍，更易逃過消毒處理，對水處理效率造成挑戰(zhàn)。同時細(xì)菌耐氯性與其感染宿主的能力呈正相關(guān)，因此該類菌可能更容易突破人體免疫防御系統(tǒng)，危害人類健康，危及再生水生物安全。

本研究并未從A廠分離到耐氯大腸桿菌。A廠使用氯消毒及紫外消毒兩種消毒方式，而B廠在采樣期間僅使用紫外消毒，因此B廠再生水中大腸桿菌含量相對較高，提高了分離到耐氯大腸桿菌的幾率。盡管耐氯大腸桿菌可降低氯消毒效力，本研究顯示A廠所使用的紫外線+氯消毒工藝仍可對其有效去除。多項研究證明，采用聯(lián)合消毒工藝，如氯消毒+紫外消毒，可通過彌補(bǔ)各自工藝不足，提高對病毒、細(xì)菌芽孢、寄生蟲的殺滅效果。因此為保障再生水生物安全性，建議聯(lián)用多種消毒工藝，以提高消毒效果。

污水中含有大量微生物，是細(xì)菌耐藥性傳播的重要場所。研究發(fā)現(xiàn)，處理后污水排入環(huán)境后，可導(dǎo)致下游水體耐藥基因濃度升高。因此再生水回用過程中，需關(guān)注其耐藥基因攜帶情況，防止再生水成為耐藥基因傳播媒介。Blaak等人發(fā)現(xiàn)污水廠出水中69%大腸桿菌菌株對所測8種抗生素敏感，而Craddock等發(fā)現(xiàn)某再生水系統(tǒng)出水中71.4%的菌株對所測24種抗生素敏感。本研究所分離大腸桿菌中50%對所有21種抗生素敏感，但僅有10%菌株耐受3種以上抗生素，因此寧波市再生水中細(xì)菌耐藥性問題尚不突出。然而，本研究共分離到3株產(chǎn)ESBL大腸桿菌，ESBL可使菌株耐受多種β-內(nèi)酰胺類抗生素，包括第三代頭孢菌素和單酰胺環(huán)類抗生素，且ESBL菌株常同時耐受其他類抗生素。產(chǎn)ESBL菌株目前在全世界流行性不斷上升，相關(guān)部門應(yīng)當(dāng)給予高度重視，加強(qiáng)臨床治療及養(yǎng)殖中抗生素使用的監(jiān)管，控制耐藥菌產(chǎn)生和傳播。同時再生水回用中也需關(guān)注此類菌株的存在情況，研究開發(fā)新型殺菌技術(shù)，降低其通過再生水傳播感染人類風(fēng)險。

04 結(jié)論

寧波兩座污水處理廠所產(chǎn)再生水符合國家再生水回用河道標(biāo)準(zhǔn)，從再生水中共分離到8株耐氯大腸桿菌，在我國尚屬首次報道。該菌的出現(xiàn)對水處理過程微生物的有效消殺提出了挑戰(zhàn)，水務(wù)部門需優(yōu)化處理工藝，提高消毒水平。同時，分離到多株耐藥大腸桿菌，其中包含耐ESBL菌株，它們的出現(xiàn)會威脅再生水回用中的生物安全，相關(guān)部門應(yīng)對細(xì)菌耐藥性進(jìn)行聯(lián)合治理，從源頭控制耐藥菌的產(chǎn)生，從傳播鏈控制耐藥菌的擴(kuò)散，保障人類健康。

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